1) Ex vivo and in vivo suppression of SARS-CoV-2 with combinatorial AAV/RNAi expression vectors
[Molecular Therapy]
Jonas Becker, Megan Lynn Stanifer, Sarah Rebecca Leist, Bettina Stolp, Olena Maiakovska, Ande West, Ellen Wiedtke, Kathleen Börner, Ali Ghanem, Ina Ambiel, Longping Victor Tse, Oliver Till Fackler, Ralph Steven Baric, Steeve Boulant, Dirk Grimm
Die dynamische Entstehung und pandemische Verbreitung von SARS-CoV-2 erforderte die rasche Entwicklung neuartiger Impfstoffe und antiviraler Therapeutika. Besonders benötigt werden weiterhin Wirkstoffe, die das Virus direkt und unabhängig von der variablen Spike-Sequenz angreifen und damit die Unterdrückung neuer Fluchtmutanten erlauben. Mit diesem Ziel haben wir Adeno-assoziierte virale (AAV) Vektoren generiert, die gleichzeitig drei verschiedene shRNAs gegen konservierte Regionen des SARS-CoV-2 Genoms exprimieren. In akut oder chronisch infizierten Zellen sowie in humanen Darmorganoiden unterdrückte der beste Vektor (AAV-SAVIOR) die virale Infektion bzw. Replikation höchst effektiv. Auch in zwei Mausmodellen konnte seine intranasale Administration die Viruslast reduzieren bzw. die Krankheitsschwere mildern. Die hohe Effektivität und die Konservierung aller shRNA-Bindestellen in Omikron machen AAV-SAVIOR zu einer vielversprechenden Waffe im Kampf gegen die weiter anhaltende Pandemie.
2) Transposasen als Werkzeug für Gentherapieanwendungen mit verbessertem Sicherheitsprofil
[Nucleic Acids Research]
Csaba Miskey, Lisa Kesselring, Irma Querques, György Abrusán, Orsolya Barabas, Zoltán Ivics
Jede gentechnische Anwendung birgt das Risiko einer Mutagenese des Genoms. Zum Beispiel integrieren die verschiedenen Arten von Genvektoren in der Regel zufällig in Chromosomen, was ein potenzielles Risiko der Insertionsmutagenese birgt. Solche genotoxischen Wirkungen können verheerende Folgen für die entsprechenden Zellen und den gesamten Organismus haben (einschließlich der Auslösung einer Krebserkrankung). Daher besteht ein großer Bedarf an gentechnischen Werkzeugen, die eine effiziente Genom-Manipulation ermöglichen und gleichzeitig potenziell genotoxische Wirkungen vermeiden.
Sleeping Beauty (SB) ist ein Transposon, das ein breites Spektrum gentechnischer Anwendungen ermöglicht, darunter die somatische Gentherapie - sowohl ex vivo als auch in vivo. Mit Hilfe von Strukturmodellen wurden am Paul-Ehrlich-Institut (PEI) drei Aminosäurereste der SB-Transposase identifiziert, welche eine entscheidende Rolle bei der Interaktion mit der Ziel-DNA spielen und die Auswahl des Orts der Integration ins Genom beeinflussen können. Auf Basis dieser Erkenntnis wurden entsprechende Aminosäure-Ersatzmutanten generiert und hinsichtlich der Wirkung auf die Integration ins Genom analysiert. Auf diesem Weg wurden einzelne Ersatzmutanten identifiziert, die zu einer entscheidenden Veränderung der genomweiten Verteilung von SB-induzierten Insertionen führen. Diese Mutationen lenken die Insertion weg von kritischen Gensequenzen (einschließlich kodierender Exons und transkriptionsregulatorischer Elemente, sogenannte Promotoren und Enhancer) hin zu weniger riskanten Bereichen im Genom. Die Enzymvarianten stellen somit eine erhebliche Verbesserung des Sicherheitsprofils einer transposonbasierten Gentherapie in Aussicht.
3) Endothelial Retargeting of AAV9 In Vivo
[Advanced Science]
Tarik Bozoglu, Seungmin Lee, Tilman Ziegler, Victoria Jurisch, Sanne Maas, Andrea Baehr, Rabea Hinkel, Amelie Hoenig, Anjana Hariharan, Christina Inyeop Kim, Simon Decker, Haider Sami, Tobias Koppara, Ruppert Oellinger, Oliver J. Müller, Derk Frank, Remco Megens, Peter Nelson, Christian Weber, Angelika Schnieke, Markus Sperandio, Gianluca Santamaria, Roland Rad, Alessandra Moretti, Karl-Ludwig Laugwitz, Oliver Soehnlein, Manfred Ogris, Christian Kupatt
Adeno-assoziierte Genvektoren (rAAVs) stellen aufgrund ihrer positiven Eigenschaften (geringe Immunogenität, geringe Integrationsrate, langfristige Genexpression) einen bevorzugten Genvektor in der Grundlagenforschung dar. Zudem haben mehrere Gentherapien basierend auf rAAVs bereits klinische Zulassungen erhalten. Basierend auf den verschiedenen Serotypen besitzen rAAVs einen Tropismus, transduzieren also bestimmte Zelltypen bevorzugt. Aktuell steht jedoch kein rAAV Serotyp zur Verfügung, der mit ausreichender Effizienz Endothelzellen transduziert. Um dieses Hindernis zu überkommen beschichteten wir rAAVs des Serotyps 9 mit PAMAM-Dendrimeren, an welche endothelspezifische Targeting-Peptide gebunden sind. So – und über die Verwendung endothelspezifischer Promotoren – konnte der muskuläre Tropismus des AAV9 hin zu Endothelzellen umgeleitet werden. Wir konnten zudem zeigen, dass dieser modifizierte Genvektor in der Lage ist, die endotheliale Funktion in verschiedenen Krankheitsmodellen in vivo zu beeinflussen, wodurch sich neue Möglichkeiten der Gentherapie von Gefäßkrankheiten ergeben.