Virale Vektoren sind bislang der Goldstandard für Gentransfer, verursachen jedoch hohe Kosten und bergen Risiken wie unkontrollierte Integration und unphysiologische Transgen-Expression. Nicht-virale Alternativen sind daher entscheidend, um sicherere, potentere und günstigere Gentherapien zu ermöglichen. Nitulescu et al. vergleichen unterschiedliche synthetisch hergestellte doppel- (ds) und einzelsträngige (ss) DNA-Moleküle für homologievermittelten, zielgerichteten Gentransfer in T-Zellen. Durch die Entwicklung von ssDNA-Donoren mit Cas12a-bindenden Sequenzen (ssCTS) erreichen sie bislang unerreichte Knock-in-Raten von bis zu 90% in primären humanen T-Zellen. Die mittels ssCTS erzeugten CAR-T-Zellen sind funktional und zeigen Hinweise auf verbessertes Proliferationspotenzial gegenüber dsDNA-basierten Ansätzen in vitro. Zudem liefert die Studie eine umfassende genotoxikologische Analyse mittels Long-Read-Sequenzierung, die zeigt, dass ssCTS die Rate an perfekte Integrationen erhöhte, während unmodifizierte ssDNA hauptsächlich partielle Integrationen erzeugte. Zusammenfassend leistet die Arbeit einen wichtigen Beitrag zur Entwicklung und Verbesserung nicht-viraler CAR-T-Herstellung.