Viviane Dettmer-Monaco∗, Kristoffer Weißert ∗, Sandra Ammann, Gianni Monaco, Lei Lei M Scabe, Linda Gräßel, Manuel Rhiel, Julia Rositzka, Masako M.Kaufmann, Kerstin Geiger, Geoffroy Andrieux, Jessica Lao, Gudrun Thoulass, Christoph Schell, Melanie Boerries, Anna L. Illert, Tatjana I.Cornu, Stephan Ehl, Peter Aichele, Toni Cathomen
Die hämophagozytäre Lymphohistiozytose (HLH) ist eine entzündliche Erkrankung, die durch einen lebensbedrohlichen Zytokinsturm mit schwerer Immunpathologie gekennzeichnet ist. Die familiäre HLH Typ 3 (FHL3) macht weltweit etwa 30% aller Fälle von angeborener HLH aus. Sie wird durch Mutationen im UNC13D-Gen verursacht und führt zu einer Beeinträchtigung der T-Zell- und NK-Zell-vermittelten Lyse von Antigen-präsentierenden Zellen. Die derzeitigen Behandlungsprotokolle, einschließlich der allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation, weisen noch immer eine hohe Mortalität auf. In unserer Studie haben wir eine kurative Genom-Editing-Strategie in einem präklinischen FHL3-Mausmodell entwickelt. Die sogenannten Jinx-Mäuse besitzen eine kryptische Spleiß-Donor-Stelle im Unc13d-Intron 26 und entwickeln nach Infektion mit dem Lymphozytären Choriomeningitis-Virus (LCMV) die klinischen Symptome der humanen FHL3. Wir verwendeten die CRISPR-Cas-Technologie, um die krankheitsverursachende Mutation in den hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) dieser Mäuse zu entfernen und transplantierten die Unc13d-editierten HSCs in konditionierte Jinx-Empfängermäuse. Die hämatopoetischen Zellen, die aus diesen transplantierten Mäusen isoliert wurden, bestätigten eine effiziente Gen-Editierung (>75%), Polyklonalität des T-Zell-Rezeptorrepertoires und keine Anzeichen von Off-Target-Effekten oder Leukämogenese. Darüber hinaus zeigten Jinx-Mäuse, die mit Unc13d-editierten Zellen transplantiert wurden, eine schnelle Virus-Clearance und Schutz vor HLH, während eine LCMV-Infektion in unbehandelten Jinx-Mäusen zu akuter HLH führte. Unsere Studie zeigt somit, dass die Transplantation von CRISPR-Cas9-editierten HSCs die Entwicklung einer funktionellen polyklonalen T-Zell-Antwort unterstützt, ohne dass es zu einer klonalen Proliferation hämatopoetischer Zellen kommt.
[Journal of Molecular Sciences]
Max Wichmann, Cecile L. Maire, Niklas Nuppenau, Moataz Habiballa, Almut Uhde, Katharina Kolbe, Tanja Schröder, Katrin Lamszus, Boris Fehse, Dawid Głów
Um Genome Editing klinisch anwenden zu können, werden neue, sichere und effiziente Vektorsystemen benötigt, die eine kurzzeitige Expression der notwendigen CRISPR/Cas Komponenten ermöglichen. Kürzlich wurden mehrere verschiedene virus-like particles (VLPs) als vielversprechende Vektoren für den Transfer des CRISPR/Cas-Systems eingeführt. In dieser Arbeit haben wir drei verschiedene Arten von Retrovirus-basierten VLPs charakterisiert und direkt verglichen: Von γ-Retroviren (Murines Leukämie-Virus, MLV) abgeleitete gRVLPs und "enhanced" egRVLPs, sowie LVLPs, die auf dem Lentivirus HIV basieren. Um die Morphologie, Oberflächenzusammensetzung, Größe und Konzentration der VLPs zu analysieren, haben wir verschiedene Assays eingesetzt (Nanopartikel-Tracking-Analyse [NTA], Multiparameter-Imaging Flow cytometry, Cas9-ELISA).
Die On- und Off-Target-Aktivitäten der drei RVLPs wurden in Zelllinien sowie humanen induzierten pluripotenten Stammzellen verglichen. Dabei zeigten die "enhanced" gRVLPs die höchsten Knockout-Raten von fast 100 % bei minimaler Off-Target-Aktivität. Zusammenfassend haben wir Methoden entwickelt, um VLPs umfassend zu charakterisieren und zu quantifizieren, wodurch eine gezieltere und somit sicherere Anwendung ermöglicht werden sollte. Wir konnten zeigen, dass egRVLP den beiden anderen Systemen (gRVLP und LVLP) deutlich überlegen sind.
[Molecular Therapy: Methods & Clinical Development]
Martin Bentler, Romain Hardet, Moritz Ertelt, Daniela Rudolf, Dorota Kaniowska, Andreas Schneider,
Florian W.R. Vondran, Clara T. Schoeder, Marion Delphin, Julie Lucifora, Michael Ott, Ulrich T. Hacker,
Sahil Adriouch, and Hildegard Büning
AAV-Vektoren stellen ein vielversprechendes Vektorsystem für die in vivo Gentherapie dar. Neben zahlreichen Studien finden AAV-Vektoren bereits in fünf zugelassenen Medikamenten Anwendung. Immunantworten gegen AAV können die Effektivität einer Gentherapie reduzieren und somit den therapeutischen Nutzen mindern. Mit der Entwicklung der neuen Kapsidvariante AAV2.MB453 haben wir eine Strategie entworfen, mit der die Ausbildung solcher Immunantworten abgeschwächt werden kann. Dabei wird spezifisch die Erkennung der AAVs durch das angeborene Immunsystems in transduzierten Zellen verringert. In primären humanen Zellen zeigte die Variante eine erhöhte Transduktionseffizienz. In Mausstudien konnten wir für AAV2.MB453 eine verringerte Anzahl an zytotoxischen T Zellen, spezifisch für das Transgen oder das Kapsid, nachweisen. Gleichzeitig zeigten diese Mäuse eine verlangsamte Bildung von anti-AAV2 Antikörpern. Die Entwicklung von AAV2.MB453 besitzt großes Potential, um in Zukunft noch effizientere AAV-Vektoren für Gentherapien zu generieren.